抗日战争时期，军统谍报网接连遭到日本驻华特务头目中村一郎（于震 饰）的疯狂破坏。为了对日特予以“以血还血、以牙还牙”的报复，军统局局长戴笠（王岗 饰）从息烽集中营中，挑选出因在淞沪战役期间阻挠军统抓捕中共地下党员而身陷囹圄的原国民革命军少校陈一鸣（庹宗华 饰）。戴笠命令陈一鸣组建一支代号“眼镜蛇”的特工突击小组，执行暗杀中村一郎的秘密任务。领命后的陈一鸣即刻行动，找来老部下冷锋，并四处招募各路高人——包括上海滩著名老千小K、燕子门掌门燕子六、建筑系硕士兼中共谍报员书生、日本陆军航空队战俘藤原刚，以及中村一郎曾经的恋人、上海滩歌女蝴蝶。这群背景各异的高手集结后，迅速投入了严酷的特种培训。恰在此时，中村一郎逮捕了美国海军情报署特工史密斯夫妇。美军上校梅乐斯紧急找到戴笠，请求军统设法营救。与此同时，中共高级特工、代号“泰山”的黄天明（侯勇 饰）收到了南京联络站站长黄云晴（吴晓敏 饰）送来的绝密情报——黄云晴通过潜伏在日军内部的内线“布谷鸟”，成功搞到了史密斯夫妇所在医院的地图与戒备情况。黄天明奉上级指示，出于抗日民族统一战线的大局，将这份关键情报故意泄露给军统南京站高站长。陈一鸣随即率领“眼镜蛇”突击小组空降渗透至南京，隐藏在萨尔神父的意大利教堂内，蓄势待发。日军很快察觉到了端倪，中村一郎一边下令全城戒严，一边准备以史密斯夫妇为诱饵，张网以待，企图让突击队自投罗网。突击小组成员们毫不畏惧，化装成日本劳军演出队巧妙混入医院，成功劫走史密斯夫妇，并将医院炸成一片火海。就在队员们准备顺利返程之际，陈一鸣却宣布，此次行动的终极任务才刚刚开始——那便是刺杀中村一郎。面对日军的层层布控与致命陷阱，他们能否在敌后的重重危机中全身而退，并顺利完成这项几乎不可能的暗杀任务……